Maintenance script: Presentation V4: sitasi, referensi, Math, Wikimedia Commons, dan atribusi

2026-08-28T17:58:25Z

Presentation V4: sitasi, referensi, Math, Wikimedia Commons, dan atribusi

Maintenance script: Impor teks terkontrol dari Wikipedia bahasa Indonesia; revisi 29601941; atribusi sumber disertakan.

2026-08-28T17:20:17Z

Impor teks terkontrol dari Wikipedia bahasa Indonesia; revisi 29601941; atribusi sumber disertakan.

Halaman baru

'''Pirosekuensing''' adalah teknik pemetaan [[DNA]] yang berdasarkan deteksi terhadap [[pirofosfat]] (PPi) yang dilepaskan selama [[sintesis]] DNA. Teknik ini memanfaatkan [[reaksi]] [[enzimatik]] yang dikatalisis oleh [[ATP sulfurilase]] dan [[luciferase]] untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan [[nukleotida]]. Teknik ini dikembangkan pada tahun [[1990]] oleh [[Mostafa Ronaghi]] dan [[Pål Nyrén]] dari Royal Institute of Technology, Stockholm.

== Prinsip ==
Metode [[sekuensi DNA]] ini bekerja berdasarkan urutan [[nukleotida]] dalam DNA dengan menggunakan prinsip sekuensi dari [[sintesis]] DNA. Teknik pyrosequencing menggunakan DNA yang diimobilisasi dalam fase [[solid]] dan diberi perlakuan dengan sistem tiga [[enzim]]. Teknik ini dilakukan dengan penambahan [[nukleotida]] yang berbeda secara berurutan kemudian [[cahaya]] yang dihasilkan dapat dideteksi untuk mengetahui di mana letak nukleotida dengan jenis tersebut berada, dilanjutkan dengan penambahan nukleotida berikutnya dan terus berulang-ulang hingga seluruh [[sekuen]] DNA terpetakan. Oleh karena itu pada teknik ini diperlukan proses pencucian di antara penambahan basa nukleotida untuk menghilangkan nukleotida pada proses sebelumnya.

Pada teknik pyrosequencing, pirofosfat inorganik yang dilepaskan dikonversikan menjadi [[ATP]] oleh ATP sulfurilase sehingga menyediakan [[energi]] bagi luciferase untuk mengoksidasi [[luciferin]] dan menghasilkan cahaya. Karena penambahan nukleotida telah diketahui jenis basanya, maka urutan cetakan DNA juga dapat ditentukan. Baik [[DNA]] maupun [[RNA]] dapat digunakan sebagai cetakan untuk pyrosequencing. Namun, [[DNA polimerase]] menunjukkan [[aktivitas]] [[katalitik]] yang lebih tinggi dibandingkan dengan [[RNA polimerase]] sehingga pada pyrosequencing lebih diutamakan penggunaan utas DNA sebagai cetakan. Secara umum, teknik ini menggunakan [[DNA]] untai tunggal yang akan disekuensi lalu mensintesis untai komplemennya dengan [[enzim]]. Aktivitas enzim DNA polimerase dalam proses sintesis untai komplemen dideteksi dengan menggunakan enzim [[kemiluminesens]], di mana akan dihasilkan [[cahaya]] ketika penambahan nukleotida ke DNA ''template'' dan [[cahaya]] tersebut yang akan diinterpretasikan sebagai sekuen hasil.

=== Prosedur ===
Pyrosequencing pada umumnya menggunakan [[fragmen Klenow]] pada DNA polimerase I yang berasal dari ''[[Escherichia coli]]'', yang memiliki aktivitas polimerase relatif lambat. Sementara itu, [[ATP sulfurilase]] yang digunakan merupakan rekombinan yang berasal dari ''[[Saccharomyces cerevisiae]]'' dan [[luciferase]] yang digunakan berasal dari [[kunang-kunang]] ''Photinus pyralis''. Reaksi keseluruhan dari proses [[polimerasi]] hingga [[deteksi]] cahaya membutuhkan 3-4 detik pada [[suhu]] ruang. Satu [[pmol]] DNA dalam reaksi pyrosequencing menghasilkan 6x10<sup>11</sup> molekul ATP yang memancarkan lebih dari 6x10<sup>9</sup> [[foton]] dengan [[panjang gelombang]] 560 nm. Pancaran cahaya tersebut dapat dengan mudah dideteksi dengan kamera CCD (''charge-coupled device''). Berikut merupakan prosedur umum untuk analisis pyrosequencing:
# DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi [[fragmen]]-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.
# Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (''single-stranded'' DNA/ssDNA).
# Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran [[mikroskopis]] yang terpisah satu sama lainnya.
# [[Reaksi berantai polimerase]] (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang [[identik]].
# Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan [[enzim]], DNA polimerase untuk menambah [[deoksinukleotida]] pada DNA untai tunggal, ATP sulfurilase yang membentuk [[ATP]] dari APS dan [[pirofosfat]] (PPi), [[luciferase]] untuk katalisis [[luciferin]] menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya, dan [[apirase]], serta [[substrat]] adenosin fosfosulfat (APS) dan luciferin.

Pada proses berjalannya sekuensi [[DNA]], masing-masing sumur [[mikroskopis]] akan dipenuhi oleh [[deoksinukleotida]], yaitu dTTP, dCTP, dan dGTP. dATP tidak digunakan karena memicu terjadinya [[reaksi]] luciferin, tetapi digunakan deoksiadenosin ά-tiotrifosfat (dATPάS) karena DNA polimerase tidak dapat membedakan antara dATP dengan dATPάS dan karena luciferase tidak mengenali dATPάS. Ini membuat [[sintesis]] untai komplemen DNA dari DNA untai tunggal terus berjalan.

Dalam tiap sumur terjadi penambahan [[nukleotida]] dan pelepasan pyrophosphate (PPi) secara [[stoikiometri]]. ATP sulfurilase mengubah pyrophosphate (PPi) menjadi ATP dengan adanya APS. ATP yang dihasilkan akan digunakan sebagai [[substrat]] untuk luciferase dalam menghasilkan cahaya dengan mengubah luciferin menjadi [[oksiluciferin]].

[[Intensitas]] cahaya yang dihasilkan berbanding lurus dengan banyaknya [[ATP]]. Cahaya yang dihasilkan akan dideteksi dengan [[detektor]] dan dianalisis dengan program. Sisa [[nukleotida]] dan ATP yang tidak terpakai akan didegradasi dengan enzim [[apirase]], dan reaksi dapat dilanjutkan dengan menambahkan [[nukleotida]] baru.

== Kelemahan ==
[[Teknik]] pyrosequencing dengan [[sistem]] tiga enzim ini masih memiliki kelemahan. Salah satu [[kendala]] terbesar pada sistem tiga enzim adalah sering terjadinya [[sinyal]] yang salah karena dATP yang ditambahkan tetapi tidak terinkorporasi pada DNA dapat menjadi [[substrat]] bagi [[luciferase]] untuk menghasilkan pendaran [[cahaya]]. Dengan demikian pemetaan DNA menjadi tidak [[akurat]]. Permasalahan ini dipecahkan dengan dikembangkannya pyrosequencing fase liquid. Pada pyrosequencing fase liquid ditambahkan enzim [[pyrase]], [[enzim]] pendegradasi nukelotida dari [[kentang]], untuk membentuk sistem empat enzim. Enzim [[pyrase]] yang ditambahkan akan mendegradasi dNTP yang tidak terinkorporasi pada DNA saat [[replikasi]] sehingga dNTP yang berlebih tidak akan menjadi substrat bagi [[luciferase]]. Selain itu karena dNTP yang berlebih sudah terdegradasi, fase solid untuk tempat DNA dan proses pencucian di antara penambahan nukleotida tidak dibutuhkan lagi. Fase solid tidak dibutuhkan karena pyrosequencing fase liquid dapat dilakukan dalam satu tabung.

== Visualisasi ==
[[Pendaran]] cahaya yang dihasilkan oleh [[aktivitas]] luciferase dengan [[substrat]] [[ATP]] dapat dideteksi dengan [[CCD]] dan divisualisasi dalam bentuk [[pyrogram]]. Pyrogram merupakan suatu grafik yang menunjukkan sekuens DNA hasil pyrosequencing melalui deteksi [[gelombang]] cahaya yang dihasilkan oleh penambahan basa nukleotida secara berurutan. Tinggi [[sinyal]] pada grafik menunjukkan seberapa banyak [[nukleotida]] yang diinkorporasi pada daerah yang berurutan. Basa-basa pada bagian bawah [[grafik]] menunjukkan urutan penambahan nukleotida sedangkan basa-basa pada bagian bawah menunjukkan sekuens DNA yang diperoleh.

== Aplikasi ==
Teknik pyrosequencing ini sangat berguna untuk [[analisis]] single-nucleotide polymorphism (SNP) karena analisis ini membutuhkan teknik yang [[sederhana]], dapat dipercaya, dan [[efektif]] dari segi biaya. Teknologi pyrosequencing menawarkan teknik yang memanfaatkan interaksi dari 4 enzim dalam satu tabung untuk mengukur sintesis DNA dengan cepat. Pyrosequencing juga menyediakan sekuens DNA dan keuntungan yang lebih dalam hal karakterisasi [[genom]] seperti sebagian besar spesies tumbuhan.

== Referensi ==

== Sumber dan atribusi ==

Konten artikel ini diadaptasi dari [https://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Pirosekuensing&oldid=29601941 Wikipedia bahasa Indonesia], revisi 29601941 (2026-08-19T22:36:36Z), yang tersedia berdasarkan lisensi Creative Commons Atribusi-BerbagiSerupa (CC BY-SA). Mohon gunakan konten ini secara bijak serta sesuai dengan ketentuan lisensi yang berlaku.

Pirosekuensing - Riwayat revisi

Maintenance script: Presentation V4: sitasi, referensi, Math, Wikimedia Commons, dan atribusi

Maintenance script: Impor teks terkontrol dari Wikipedia bahasa Indonesia; revisi 29601941; atribusi sumber disertakan.