Lompat ke isi

Pirosekuensing: Perbedaan antara revisi

Ensiklopedia Pengetahuan Universitas Islam Sultan Agung

Maintenance script (bicara | kontrib)

37.956 suntingan
Maintenance script (bicara | kontrib)
37.956 suntingan
Impor teks terkontrol dari Wikipedia bahasa Indonesia; revisi 29601941; atribusi sumber disertakan.
 
Maintenance script (bicara | kontrib)
37.956 suntingan
Presentation V4: sitasi, referensi, Math, Wikimedia Commons, dan atribusi
 
Baris 1: Baris 1:
'''Pirosekuensing''' adalah teknik pemetaan [[DNA]] yang berdasarkan deteksi terhadap [[pirofosfat]] (PPi) yang dilepaskan selama [[sintesis]] DNA. Teknik ini memanfaatkan [[reaksi]] [[enzimatik]] yang dikatalisis oleh [[ATP sulfurilase]] dan [[luciferase]] untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan [[nukleotida]]. Teknik ini dikembangkan pada tahun [[1990]] oleh [[Mostafa Ronaghi]] dan [[Pål Nyrén]] dari Royal Institute of Technology, Stockholm.
[[File:Pyrogram1.jpg|thumb|right|280px|Hasil visualisasi Pyrogram]]
 
'''Pirosekuensing''' adalah teknik pemetaan [[DNA]] yang berdasarkan deteksi terhadap [[pirofosfat]] (PPi) yang dilepaskan selama [[sintesis]] DNA.<ref>Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref> Teknik ini memanfaatkan [[reaksi]] [[enzimatik]] yang dikatalisis oleh [[ATP sulfurilase]] dan [[luciferase]] untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan [[nukleotida]].<ref>Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref> Teknik ini dikembangkan pada tahun [[1990]] oleh [[Mostafa Ronaghi]] dan [[Pål Nyrén]] dari Royal Institute of Technology, Stockholm.<ref>Nyrén P. 2007. The History of Pyrosequencing. ''Methods Mol Biology'' 373: 1–14.</ref>


== Prinsip ==
== Prinsip ==
Metode [[sekuensi DNA]] ini bekerja berdasarkan urutan [[nukleotida]] dalam DNA dengan menggunakan prinsip sekuensi dari [[sintesis]] DNA. Teknik pyrosequencing menggunakan DNA yang diimobilisasi dalam fase [[solid]] dan diberi perlakuan dengan sistem tiga [[enzim]]. Teknik ini dilakukan dengan penambahan [[nukleotida]] yang berbeda secara berurutan kemudian [[cahaya]] yang dihasilkan dapat dideteksi untuk mengetahui di mana letak nukleotida dengan jenis tersebut berada, dilanjutkan dengan penambahan nukleotida berikutnya dan terus berulang-ulang hingga seluruh [[sekuen]] DNA terpetakan. Oleh karena itu pada teknik ini diperlukan proses pencucian di antara penambahan basa nukleotida untuk menghilangkan nukleotida pada proses sebelumnya.
Metode [[sekuensi DNA]] ini bekerja berdasarkan urutan [[nukleotida]] dalam DNA dengan menggunakan prinsip sekuensi dari [[sintesis]] DNA. Teknik pyrosequencing menggunakan DNA yang diimobilisasi dalam fase [[solid]] dan diberi perlakuan dengan sistem tiga [[enzim]].<ref>Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.</ref> Teknik ini dilakukan dengan penambahan [[nukleotida]] yang berbeda secara berurutan kemudian [[cahaya]] yang dihasilkan dapat dideteksi untuk mengetahui di mana letak nukleotida dengan jenis tersebut berada, dilanjutkan dengan penambahan nukleotida berikutnya dan terus berulang-ulang hingga seluruh [[sekuen]] DNA terpetakan.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref> Oleh karena itu pada teknik ini diperlukan proses pencucian di antara penambahan basa nukleotida untuk menghilangkan nukleotida pada proses sebelumnya.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref>


Pada teknik pyrosequencing, pirofosfat inorganik yang dilepaskan dikonversikan menjadi [[ATP]] oleh ATP sulfurilase sehingga menyediakan [[energi]] bagi luciferase untuk mengoksidasi [[luciferin]] dan menghasilkan cahaya. Karena penambahan nukleotida telah diketahui jenis basanya, maka urutan cetakan DNA juga dapat ditentukan. Baik [[DNA]] maupun [[RNA]] dapat digunakan sebagai cetakan untuk pyrosequencing. Namun, [[DNA polimerase]] menunjukkan [[aktivitas]] [[katalitik]] yang lebih tinggi dibandingkan dengan [[RNA polimerase]] sehingga pada pyrosequencing lebih diutamakan penggunaan utas DNA sebagai cetakan. Secara umum, teknik ini menggunakan [[DNA]] untai tunggal yang akan disekuensi lalu mensintesis untai komplemennya dengan [[enzim]]. Aktivitas enzim DNA polimerase dalam proses sintesis untai komplemen dideteksi dengan menggunakan enzim [[kemiluminesens]], di mana akan dihasilkan [[cahaya]] ketika penambahan nukleotida ke DNA ''template'' dan [[cahaya]] tersebut yang akan diinterpretasikan sebagai sekuen hasil.
Pada teknik pyrosequencing, pirofosfat inorganik yang dilepaskan dikonversikan menjadi [[ATP]] oleh ATP sulfurilase sehingga menyediakan [[energi]] bagi luciferase untuk mengoksidasi [[luciferin]] dan menghasilkan cahaya.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref> Karena penambahan nukleotida telah diketahui jenis basanya, maka urutan cetakan DNA juga dapat ditentukan.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref> Baik [[DNA]] maupun [[RNA]] dapat digunakan sebagai cetakan untuk pyrosequencing.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref> Namun, [[DNA polimerase]] menunjukkan [[aktivitas]] [[katalitik]] yang lebih tinggi dibandingkan dengan [[RNA polimerase]] sehingga pada pyrosequencing lebih diutamakan penggunaan utas DNA sebagai cetakan.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref><ref>Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.</ref> Secara umum, teknik ini menggunakan [[DNA]] untai tunggal yang akan disekuensi lalu mensintesis untai komplemennya dengan [[enzim]].<ref>Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.</ref> Aktivitas enzim DNA polimerase dalam proses sintesis untai komplemen dideteksi dengan menggunakan enzim [[kemiluminesens]], di mana akan dihasilkan [[cahaya]] ketika penambahan nukleotida ke DNA ''template'' dan [[cahaya]] tersebut yang akan diinterpretasikan sebagai sekuen hasil.<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref>


=== Prosedur ===
=== Prosedur ===
Pyrosequencing pada umumnya menggunakan [[fragmen Klenow]] pada DNA polimerase I yang berasal dari ''[[Escherichia coli]]'', yang memiliki aktivitas polimerase relatif lambat. Sementara itu, [[ATP sulfurilase]] yang digunakan merupakan rekombinan yang berasal dari ''[[Saccharomyces cerevisiae]]'' dan [[luciferase]] yang digunakan berasal dari [[kunang-kunang]] ''Photinus pyralis''. Reaksi keseluruhan dari proses [[polimerasi]] hingga [[deteksi]] cahaya membutuhkan 3-4 detik pada [[suhu]] ruang. Satu [[pmol]] DNA dalam reaksi pyrosequencing menghasilkan 6x10<sup>11</sup> molekul ATP yang memancarkan lebih dari 6x10<sup>9</sup> [[foton]] dengan [[panjang gelombang]] 560 nm. Pancaran cahaya tersebut dapat dengan mudah dideteksi dengan kamera CCD (''charge-coupled device''). Berikut merupakan prosedur umum untuk analisis pyrosequencing:
Pyrosequencing pada umumnya menggunakan [[fragmen Klenow]] pada DNA polimerase I yang berasal dari ''[[Escherichia coli]]'', yang memiliki aktivitas polimerase relatif lambat.<ref>Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.</ref> Sementara itu, [[ATP sulfurilase]] yang digunakan merupakan rekombinan yang berasal dari ''[[Saccharomyces cerevisiae]]'' dan [[luciferase]] yang digunakan berasal dari [[kunang-kunang]] ''Photinus pyralis''.<ref>Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.</ref> Reaksi keseluruhan dari proses [[polimerasi]] hingga [[deteksi]] cahaya membutuhkan 3-4 detik pada [[suhu]] ruang.<ref>Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.</ref> Satu [[pmol]] DNA dalam reaksi pyrosequencing menghasilkan 6x10<sup>11</sup> molekul ATP yang memancarkan lebih dari 6x10<sup>9</sup> [[foton]] dengan [[panjang gelombang]] 560 nm.<ref>Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.</ref> Pancaran cahaya tersebut dapat dengan mudah dideteksi dengan kamera CCD (''charge-coupled device'').<ref>Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref> Berikut merupakan prosedur umum untuk analisis pyrosequencing:
# DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi [[fragmen]]-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.
# DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi [[fragmen]]-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref>
# Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (''single-stranded'' DNA/ssDNA).
# Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (''single-stranded'' DNA/ssDNA).<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref>
# Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran [[mikroskopis]] yang terpisah satu sama lainnya.
# Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran [[mikroskopis]] yang terpisah satu sama lainnya.<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref>
# [[Reaksi berantai polimerase]] (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang [[identik]].
# [[Reaksi berantai polimerase]] (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang [[identik]].<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref>
# Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan [[enzim]], DNA polimerase untuk menambah [[deoksinukleotida]] pada DNA untai tunggal, ATP sulfurilase yang membentuk [[ATP]] dari APS dan [[pirofosfat]] (PPi), [[luciferase]] untuk katalisis [[luciferin]] menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya, dan [[apirase]], serta [[substrat]] adenosin fosfosulfat (APS) dan luciferin.
# Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan [[enzim]], DNA polimerase untuk menambah [[deoksinukleotida]] pada DNA untai tunggal, ATP sulfurilase yang membentuk [[ATP]] dari APS dan [[pirofosfat]] (PPi), [[luciferase]] untuk katalisis [[luciferin]] menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya, dan [[apirase]], serta [[substrat]] adenosin fosfosulfat (APS) dan luciferin.<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref>


Pada proses berjalannya sekuensi [[DNA]], masing-masing sumur [[mikroskopis]] akan dipenuhi oleh [[deoksinukleotida]], yaitu dTTP, dCTP, dan dGTP. dATP tidak digunakan karena memicu terjadinya [[reaksi]] luciferin, tetapi digunakan deoksiadenosin ά-tiotrifosfat (dATPάS) karena DNA polimerase tidak dapat membedakan antara dATP dengan dATPάS dan karena luciferase tidak mengenali dATPάS. Ini membuat [[sintesis]] untai komplemen DNA dari DNA untai tunggal terus berjalan.
Pada proses berjalannya sekuensi [[DNA]], masing-masing sumur [[mikroskopis]] akan dipenuhi oleh [[deoksinukleotida]], yaitu dTTP, dCTP, dan dGTP.<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref> dATP tidak digunakan karena memicu terjadinya [[reaksi]] luciferin, tetapi digunakan deoksiadenosin ά-tiotrifosfat (dATPάS) karena DNA polimerase tidak dapat membedakan antara dATP dengan dATPάS dan karena luciferase tidak mengenali dATPάS.<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref> Ini membuat [[sintesis]] untai komplemen DNA dari DNA untai tunggal terus berjalan.<ref>Fakhrai-Rad ''et al''. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. ''Hum Mutat''. 19: 479.</ref>


Dalam tiap sumur terjadi penambahan [[nukleotida]] dan pelepasan pyrophosphate (PPi) secara [[stoikiometri]]. ATP sulfurilase mengubah pyrophosphate (PPi) menjadi ATP dengan adanya APS. ATP yang dihasilkan akan digunakan sebagai [[substrat]] untuk luciferase dalam menghasilkan cahaya dengan mengubah luciferin menjadi [[oksiluciferin]].
Dalam tiap sumur terjadi penambahan [[nukleotida]] dan pelepasan pyrophosphate (PPi) secara [[stoikiometri]].<ref>Elahi ''et al''. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.</ref> ATP sulfurilase mengubah pyrophosphate (PPi) menjadi ATP dengan adanya APS.<ref>Elahi ''et al''. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.</ref> ATP yang dihasilkan akan digunakan sebagai [[substrat]] untuk luciferase dalam menghasilkan cahaya dengan mengubah luciferin menjadi [[oksiluciferin]].<ref>Elahi ''et al''. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.</ref>


[[Intensitas]] cahaya yang dihasilkan berbanding lurus dengan banyaknya [[ATP]]. Cahaya yang dihasilkan akan dideteksi dengan [[detektor]] dan dianalisis dengan program. Sisa [[nukleotida]] dan ATP yang tidak terpakai akan didegradasi dengan enzim [[apirase]], dan reaksi dapat dilanjutkan dengan menambahkan [[nukleotida]] baru.
[[Intensitas]] cahaya yang dihasilkan berbanding lurus dengan banyaknya [[ATP]]. Cahaya yang dihasilkan akan dideteksi dengan [[detektor]] dan dianalisis dengan program.<ref>Elahi ''et al''. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.</ref> Sisa [[nukleotida]] dan ATP yang tidak terpakai akan didegradasi dengan enzim [[apirase]], dan reaksi dapat dilanjutkan dengan menambahkan [[nukleotida]] baru.<ref>Elahi ''et al''. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.</ref>


== Kelemahan ==
== Kelemahan ==
[[Teknik]] pyrosequencing dengan [[sistem]] tiga enzim ini masih memiliki kelemahan. Salah satu [[kendala]] terbesar pada sistem tiga enzim adalah sering terjadinya [[sinyal]] yang salah karena dATP yang ditambahkan tetapi tidak terinkorporasi pada DNA dapat menjadi [[substrat]] bagi [[luciferase]] untuk menghasilkan pendaran [[cahaya]]. Dengan demikian pemetaan DNA menjadi tidak [[akurat]]. Permasalahan ini dipecahkan dengan dikembangkannya pyrosequencing fase liquid. Pada pyrosequencing fase liquid ditambahkan enzim [[pyrase]], [[enzim]] pendegradasi nukelotida dari [[kentang]], untuk membentuk sistem empat enzim. Enzim [[pyrase]] yang ditambahkan akan mendegradasi dNTP yang tidak terinkorporasi pada DNA saat [[replikasi]] sehingga dNTP yang berlebih tidak akan menjadi substrat bagi [[luciferase]]. Selain itu karena dNTP yang berlebih sudah terdegradasi, fase solid untuk tempat DNA dan proses pencucian di antara penambahan nukleotida tidak dibutuhkan lagi. Fase solid tidak dibutuhkan karena pyrosequencing fase liquid dapat dilakukan dalam satu tabung.
[[Teknik]] pyrosequencing dengan [[sistem]] tiga enzim ini masih memiliki kelemahan.<ref>Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.</ref> Salah satu [[kendala]] terbesar pada sistem tiga enzim adalah sering terjadinya [[sinyal]] yang salah karena dATP yang ditambahkan tetapi tidak terinkorporasi pada DNA dapat menjadi [[substrat]] bagi [[luciferase]] untuk menghasilkan pendaran [[cahaya]].<ref>Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.</ref> Dengan demikian pemetaan DNA menjadi tidak [[akurat]]. Permasalahan ini dipecahkan dengan dikembangkannya pyrosequencing fase liquid.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref> Pada pyrosequencing fase liquid ditambahkan enzim [[pyrase]], [[enzim]] pendegradasi nukelotida dari [[kentang]], untuk membentuk sistem empat enzim.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref> Enzim [[pyrase]] yang ditambahkan akan mendegradasi dNTP yang tidak terinkorporasi pada DNA saat [[replikasi]] sehingga dNTP yang berlebih tidak akan menjadi substrat bagi [[luciferase]].<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref> Selain itu karena dNTP yang berlebih sudah terdegradasi, fase solid untuk tempat DNA dan proses pencucian di antara penambahan nukleotida tidak dibutuhkan lagi. Fase solid tidak dibutuhkan karena pyrosequencing fase liquid dapat dilakukan dalam satu tabung.<ref>Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. ''Genome Res'' 11:3-11.</ref>


== Visualisasi ==
== Visualisasi ==
[[Pendaran]] cahaya yang dihasilkan oleh [[aktivitas]] luciferase dengan [[substrat]] [[ATP]] dapat dideteksi dengan [[CCD]] dan divisualisasi dalam bentuk [[pyrogram]]. Pyrogram merupakan suatu grafik yang menunjukkan sekuens DNA hasil pyrosequencing melalui deteksi [[gelombang]] cahaya yang dihasilkan oleh penambahan basa nukleotida secara berurutan. Tinggi [[sinyal]] pada grafik menunjukkan seberapa banyak [[nukleotida]] yang diinkorporasi pada daerah yang berurutan. Basa-basa pada bagian bawah [[grafik]] menunjukkan urutan penambahan nukleotida sedangkan basa-basa pada bagian bawah menunjukkan sekuens DNA yang diperoleh.
[[Pendaran]] cahaya yang dihasilkan oleh [[aktivitas]] luciferase dengan [[substrat]] [[ATP]] dapat dideteksi dengan [[CCD]] dan divisualisasi dalam bentuk [[pyrogram]].<ref>Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref> Pyrogram merupakan suatu grafik yang menunjukkan sekuens DNA hasil pyrosequencing melalui deteksi [[gelombang]] cahaya yang dihasilkan oleh penambahan basa nukleotida secara berurutan.<ref>Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref> Tinggi [[sinyal]] pada grafik menunjukkan seberapa banyak [[nukleotida]] yang diinkorporasi pada daerah yang berurutan.<ref>Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref> Basa-basa pada bagian bawah [[grafik]] menunjukkan urutan penambahan nukleotida sedangkan basa-basa pada bagian bawah menunjukkan sekuens DNA yang diperoleh.<ref>Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. ''J Clin Microbiol'' 44(8):3008-11.</ref>


== Aplikasi ==
== Aplikasi ==
Teknik pyrosequencing ini sangat berguna untuk [[analisis]] single-nucleotide polymorphism (SNP) karena analisis ini membutuhkan teknik yang [[sederhana]], dapat dipercaya, dan [[efektif]] dari segi biaya. Teknologi pyrosequencing menawarkan teknik yang memanfaatkan interaksi dari 4 enzim dalam satu tabung untuk mengukur sintesis DNA dengan cepat. Pyrosequencing juga menyediakan sekuens DNA dan keuntungan yang lebih dalam hal karakterisasi [[genom]] seperti sebagian besar spesies tumbuhan.
Teknik pyrosequencing ini sangat berguna untuk [[analisis]] single-nucleotide polymorphism (SNP) karena analisis ini membutuhkan teknik yang [[sederhana]], dapat dipercaya, dan [[efektif]] dari segi biaya.<ref>Pourmand N, Elahi E, Davis RW, Ronaghi M. 2002. Multiple pyrosequencing. ''Nucl Acids Res'' 30(7):1-5.</ref> Teknologi pyrosequencing menawarkan teknik yang memanfaatkan interaksi dari 4 enzim dalam satu tabung untuk mengukur sintesis DNA dengan cepat.<ref>Pourmand N, Elahi E, Davis RW, Ronaghi M. 2002. Multiple pyrosequencing. ''Nucl Acids Res'' 30(7):1-5.</ref> Pyrosequencing juga menyediakan sekuens DNA dan keuntungan yang lebih dalam hal karakterisasi [[genom]] seperti sebagian besar spesies tumbuhan.<ref>Pacey-Miller T, Henry R. 2003. Single-nucleotide polymorphism detection in plants using a single-stranded pyrosequencing protocol with a universal biotinylated primer. ''Anal Biochem'' 317(2):166-170.</ref>


== Referensi ==
== Referensi ==
<references />


== Sumber dan atribusi ==


Konten artikel ini diadaptasi dari [https://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Pirosekuensing&oldid=29601941 Wikipedia bahasa Indonesia], revisi 29601941 (2026-08-19T22:36:36Z), yang tersedia berdasarkan lisensi Creative Commons Atribusi-BerbagiSerupa (CC BY-SA). Gambar pada artikel ini bersumber dari Wikimedia Commons dan mengikuti ketentuan lisensi masing-masing berkas. Mohon gunakan konten dan media secara bijak serta sesuai dengan ketentuan lisensi yang berlaku.


== Sumber dan atribusi ==
<!-- WIKI_UNISSULA_PRESENTATION_V4 -->
 
Konten artikel ini diadaptasi dari [https://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Pirosekuensing&oldid=29601941 Wikipedia bahasa Indonesia], revisi 29601941 (2026-08-19T22:36:36Z), yang tersedia berdasarkan lisensi Creative Commons Atribusi-BerbagiSerupa (CC BY-SA). Mohon gunakan konten ini secara bijak serta sesuai dengan ketentuan lisensi yang berlaku.

Revisi terkini sejak 28 Agustus 2026 17.58

Hasil visualisasi Pyrogram

Pirosekuensing adalah teknik pemetaan DNA yang berdasarkan deteksi terhadap pirofosfat (PPi) yang dilepaskan selama sintesis DNA.[1] Teknik ini memanfaatkan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh ATP sulfurilase dan luciferase untuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahan nukleotida.[2] Teknik ini dikembangkan pada tahun 1990 oleh Mostafa Ronaghi dan Pål Nyrén dari Royal Institute of Technology, Stockholm.[3]

Prinsip

Metode sekuensi DNA ini bekerja berdasarkan urutan nukleotida dalam DNA dengan menggunakan prinsip sekuensi dari sintesis DNA. Teknik pyrosequencing menggunakan DNA yang diimobilisasi dalam fase solid dan diberi perlakuan dengan sistem tiga enzim.[4] Teknik ini dilakukan dengan penambahan nukleotida yang berbeda secara berurutan kemudian cahaya yang dihasilkan dapat dideteksi untuk mengetahui di mana letak nukleotida dengan jenis tersebut berada, dilanjutkan dengan penambahan nukleotida berikutnya dan terus berulang-ulang hingga seluruh sekuen DNA terpetakan.[5] Oleh karena itu pada teknik ini diperlukan proses pencucian di antara penambahan basa nukleotida untuk menghilangkan nukleotida pada proses sebelumnya.[6]

Pada teknik pyrosequencing, pirofosfat inorganik yang dilepaskan dikonversikan menjadi ATP oleh ATP sulfurilase sehingga menyediakan energi bagi luciferase untuk mengoksidasi luciferin dan menghasilkan cahaya.[7] Karena penambahan nukleotida telah diketahui jenis basanya, maka urutan cetakan DNA juga dapat ditentukan.[8] Baik DNA maupun RNA dapat digunakan sebagai cetakan untuk pyrosequencing.[9] Namun, DNA polimerase menunjukkan aktivitas katalitik yang lebih tinggi dibandingkan dengan RNA polimerase sehingga pada pyrosequencing lebih diutamakan penggunaan utas DNA sebagai cetakan.[10][11] Secara umum, teknik ini menggunakan DNA untai tunggal yang akan disekuensi lalu mensintesis untai komplemennya dengan enzim.[12] Aktivitas enzim DNA polimerase dalam proses sintesis untai komplemen dideteksi dengan menggunakan enzim kemiluminesens, di mana akan dihasilkan cahaya ketika penambahan nukleotida ke DNA template dan cahaya tersebut yang akan diinterpretasikan sebagai sekuen hasil.[13]

Prosedur

Pyrosequencing pada umumnya menggunakan fragmen Klenow pada DNA polimerase I yang berasal dari Escherichia coli, yang memiliki aktivitas polimerase relatif lambat.[14] Sementara itu, ATP sulfurilase yang digunakan merupakan rekombinan yang berasal dari Saccharomyces cerevisiae dan luciferase yang digunakan berasal dari kunang-kunang Photinus pyralis.[15] Reaksi keseluruhan dari proses polimerasi hingga deteksi cahaya membutuhkan 3-4 detik pada suhu ruang.[16] Satu pmol DNA dalam reaksi pyrosequencing menghasilkan 6x1011 molekul ATP yang memancarkan lebih dari 6x109 foton dengan panjang gelombang 560 nm.[17] Pancaran cahaya tersebut dapat dengan mudah dideteksi dengan kamera CCD (charge-coupled device).[18] Berikut merupakan prosedur umum untuk analisis pyrosequencing:

  1. DNA yang akan disekuensi dipotong menjadi fragmen-fragmen sepanjang kira-kira 100 bp.[19]
  2. Fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi menjadi DNA untai tunggal (single-stranded DNA/ssDNA).[20]
  3. Tiap DNA untai tunggal tersebut ditempel pada manik-manik berukuran mikroskopis yang terpisah satu sama lainnya.[21]
  4. Reaksi berantai polimerase (PCR) dijalankan pada masing-masing manik-manik sehingga dari tiap manik-manik didapat kira-kira 10 juta kopi ssDNA yang identik.[22]
  5. Manik-manik dimasukkan ke dalam sumur-sumur mikroskopis (berjumlah kira-kira 200 ribu) yang masing-masingnya berisikan enzim, DNA polimerase untuk menambah deoksinukleotida pada DNA untai tunggal, ATP sulfurilase yang membentuk ATP dari APS dan pirofosfat (PPi), luciferase untuk katalisis luciferin menjadi oksiluciferin yang menghasilkan cahaya, dan apirase, serta substrat adenosin fosfosulfat (APS) dan luciferin.[23]

Pada proses berjalannya sekuensi DNA, masing-masing sumur mikroskopis akan dipenuhi oleh deoksinukleotida, yaitu dTTP, dCTP, dan dGTP.[24] dATP tidak digunakan karena memicu terjadinya reaksi luciferin, tetapi digunakan deoksiadenosin ά-tiotrifosfat (dATPάS) karena DNA polimerase tidak dapat membedakan antara dATP dengan dATPάS dan karena luciferase tidak mengenali dATPάS.[25] Ini membuat sintesis untai komplemen DNA dari DNA untai tunggal terus berjalan.[26]

Dalam tiap sumur terjadi penambahan nukleotida dan pelepasan pyrophosphate (PPi) secara stoikiometri.[27] ATP sulfurilase mengubah pyrophosphate (PPi) menjadi ATP dengan adanya APS.[28] ATP yang dihasilkan akan digunakan sebagai substrat untuk luciferase dalam menghasilkan cahaya dengan mengubah luciferin menjadi oksiluciferin.[29]

Intensitas cahaya yang dihasilkan berbanding lurus dengan banyaknya ATP. Cahaya yang dihasilkan akan dideteksi dengan detektor dan dianalisis dengan program.[30] Sisa nukleotida dan ATP yang tidak terpakai akan didegradasi dengan enzim apirase, dan reaksi dapat dilanjutkan dengan menambahkan nukleotida baru.[31]

Kelemahan

Teknik pyrosequencing dengan sistem tiga enzim ini masih memiliki kelemahan.[32] Salah satu kendala terbesar pada sistem tiga enzim adalah sering terjadinya sinyal yang salah karena dATP yang ditambahkan tetapi tidak terinkorporasi pada DNA dapat menjadi substrat bagi luciferase untuk menghasilkan pendaran cahaya.[33] Dengan demikian pemetaan DNA menjadi tidak akurat. Permasalahan ini dipecahkan dengan dikembangkannya pyrosequencing fase liquid.[34] Pada pyrosequencing fase liquid ditambahkan enzim pyrase, enzim pendegradasi nukelotida dari kentang, untuk membentuk sistem empat enzim.[35] Enzim pyrase yang ditambahkan akan mendegradasi dNTP yang tidak terinkorporasi pada DNA saat replikasi sehingga dNTP yang berlebih tidak akan menjadi substrat bagi luciferase.[36] Selain itu karena dNTP yang berlebih sudah terdegradasi, fase solid untuk tempat DNA dan proses pencucian di antara penambahan nukleotida tidak dibutuhkan lagi. Fase solid tidak dibutuhkan karena pyrosequencing fase liquid dapat dilakukan dalam satu tabung.[37]

Visualisasi

Pendaran cahaya yang dihasilkan oleh aktivitas luciferase dengan substrat ATP dapat dideteksi dengan CCD dan divisualisasi dalam bentuk pyrogram.[38] Pyrogram merupakan suatu grafik yang menunjukkan sekuens DNA hasil pyrosequencing melalui deteksi gelombang cahaya yang dihasilkan oleh penambahan basa nukleotida secara berurutan.[39] Tinggi sinyal pada grafik menunjukkan seberapa banyak nukleotida yang diinkorporasi pada daerah yang berurutan.[40] Basa-basa pada bagian bawah grafik menunjukkan urutan penambahan nukleotida sedangkan basa-basa pada bagian bawah menunjukkan sekuens DNA yang diperoleh.[41]

Aplikasi

Teknik pyrosequencing ini sangat berguna untuk analisis single-nucleotide polymorphism (SNP) karena analisis ini membutuhkan teknik yang sederhana, dapat dipercaya, dan efektif dari segi biaya.[42] Teknologi pyrosequencing menawarkan teknik yang memanfaatkan interaksi dari 4 enzim dalam satu tabung untuk mengukur sintesis DNA dengan cepat.[43] Pyrosequencing juga menyediakan sekuens DNA dan keuntungan yang lebih dalam hal karakterisasi genom seperti sebagian besar spesies tumbuhan.[44]

Referensi

  1. ↑ Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.
  2. ↑ Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.
  3. ↑ Nyrén P. 2007. The History of Pyrosequencing. Methods Mol Biology 373: 1–14.
  4. ↑ Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.
  5. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  6. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  7. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  8. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  9. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  10. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  11. ↑ Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.
  12. ↑ Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.
  13. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  14. ↑ Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.
  15. ↑ Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.
  16. ↑ Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.
  17. ↑ Marsh S, King CR, Garsa AA, McLeod HL. 2005. Pyrosequencing of Clinically Relevant Polymorphisms. Washington: Humana Press. Hal. 37-44.
  18. ↑ Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.
  19. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  20. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  21. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  22. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  23. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  24. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  25. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  26. ↑ Fakhrai-Rad et al. 2002. Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum Mutat. 19: 479.
  27. ↑ Elahi et al. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.
  28. ↑ Elahi et al. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.
  29. ↑ Elahi et al. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.
  30. ↑ Elahi et al. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.
  31. ↑ Elahi et al. 2004. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol Biol 255: 211–219.
  32. ↑ Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.
  33. ↑ Priest FG. 1984. Extracellular Enzymes. England: Van Nostrand Reinhold. Hal. 67-71.
  34. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  35. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  36. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  37. ↑ Ronaghi M. 2001. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 11:3-11.
  38. ↑ Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.
  39. ↑ Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.
  40. ↑ Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.
  41. ↑ Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases. J Clin Microbiol 44(8):3008-11.
  42. ↑ Pourmand N, Elahi E, Davis RW, Ronaghi M. 2002. Multiple pyrosequencing. Nucl Acids Res 30(7):1-5.
  43. ↑ Pourmand N, Elahi E, Davis RW, Ronaghi M. 2002. Multiple pyrosequencing. Nucl Acids Res 30(7):1-5.
  44. ↑ Pacey-Miller T, Henry R. 2003. Single-nucleotide polymorphism detection in plants using a single-stranded pyrosequencing protocol with a universal biotinylated primer. Anal Biochem 317(2):166-170.

Sumber dan atribusi

Konten artikel ini diadaptasi dari Wikipedia bahasa Indonesia, revisi 29601941 (2026-08-19T22:36:36Z), yang tersedia berdasarkan lisensi Creative Commons Atribusi-BerbagiSerupa (CC BY-SA). Gambar pada artikel ini bersumber dari Wikimedia Commons dan mengikuti ketentuan lisensi masing-masing berkas. Mohon gunakan konten dan media secara bijak serta sesuai dengan ketentuan lisensi yang berlaku.


Diperoleh dari "https://wiki.unissula.ac.id/index.php?title=Pirosekuensing&oldid=23364"